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Comment est-il prélevé ?

1) Comment l’ADN est-il prélevé sur un lieu de crime ?

Le plus souvent les enquêteurs cherchent à identifier un individu à partir d’un ou plusieurs échantillons de cheveux, de sang, de sperme ou de salive. Des traces que le criminel aurait laissé sur une ou plusieurs pièces dites à conviction.

Il ne faut en aucun cas toucher quelque chose avant que les experts n’arrivent afin de ne pas polluer le lieu avec notre propre ADN, car même en perdant un seul cheveu cela peut rendre les résultats invalides .C’est donc pour cela que les experts endossent une combinaison intégrale en plastique et se munissent d’un calot, d’une paire de gant et de couvre-chaussures.

Ils ne doivent laisser aucun indice de coté et pour cela ils ont divers moyens a leur disposition, pinces, grattoirs, tamponnoir (pastilles d’aluminium recouvertes d’un adhésif double face qui permet de récolter toutes les particules)

Le prélèvement se fait après le crime sur le terrain pendant une autopsie , ou directement sur les suspects , cela consiste par exemple à prendre quelques cheveux , curer les ongles , relever les empreintes digitales , observer les vêtements et objets ensanglantés .Les agents appliquent ces prélèvements sur un « carton » imprégné de détergent , afin de séparer les cellules de leur noyau. Ainsi libéré et fixé l’ADN peut-être stocké pendant une durée de quatre ans .

Le but est de constitué un dossier avec toutes les références biologiques des individus.

Il y a aussi des prélèvements pour micro-analyse pour identifier la victime et la date du décès, on s’intéresse donc aux insectes nécrophages, les études dentaires, l’analyse des plaies, les données anthropométriques, …

Les enquêteurs doivent aussi procéder à un examen minutieux pour repérer les taches de sang, car les criminels plutôt méticuleux essayent de faire disparaitre les traces de sang ce qui est inutile face aux moyens modernes et techniques de la police scientifique.

Dans le sang (hémoglobine) on peut retrouver des molécules d’ADN et ainsi retrouver la victime ou le criminel.

  • Pour ce faire, il y a la méthode d’orientation (la moins fiable) qui réside en l’utilisation d’eau oxygénée .Ce test a été découvert par le chimiste allemand Schönbein en 1863. Il se manifeste par une effervescence : s’il y a présence d’hémoglobine, de la mousse blanche apparait. (L’effervescence est du au dégagement d’oxygene )

L’eau oxygénée se décompose selon l’équation suivante :

H2O2 + H2O2 -----------> 2 H2O + O2

Cette équation est une réaction d’oxydoréduction: une réaction d’oxydoréduction est une réaction qui met en jeu un transfert d’électron entre ses réactifs.

On effectue les deux demi-équations d’oxydoréduction puis on les ajoute :

H2O2(aq) + 2H+(aq) + 2e- = 2H2O(l)

H2O2(aq) = 02(g) + 2H+(aq) +2e -

H2O2(aq) + 2H+(aq) + 2e- + H2O2(aq) --> 2H2O(l) + O2(g) + 2H+(aq) + 2e-

H2O2(aq) + H2O2(aq) --> 2H2O(l) + O2(g)

 

On peut constater que le sang n’apparaît ni dans les réactifs, ni dans les produits…

Sans la présence de sang, l’eau oxygénée se décompose en eau et en dioxygène mais la réaction est très longue. La molécule d’hémoglobine du sang est donc un catalyseur : elle accélère la réaction .

 

  • La méthode de certitude qui permet de mettre en évidence des dérivés chimiques caractéristiques de l’hémoglobine. A l’aide d’un spectroscope on recherche l’hémoglobine alcaline qui est un dérivé chimique obtenue à partir d’oxyhémoglobine du sang.

Ou également à l’aide d’acide, elle se dissocie alors, et l’une de ses parties donne le chlorhydrate d’hématine qui cristallise en prisme allongé, brun violacé.

 

2 ) L’arrivée du scellé :

Les scellés arrivent au laboratoire exclusivement par voie postale puis sont stockés dans une pièce prévue à cet effet. Il existe deux sortent de scellé :

  • Les objets (que l’on appelle scellé de question comme un couteau par exemple)

  • Les prélèvements (que l’on appelle scellé de prélèvement)

Ces deux analyses se font séparément afin d’éviter tout risque de contamination.

Ceux de prélèvement arrivent dans une enveloppe sur laquelle est inscrit, le nom de l’individu prélevé ainsi qu’un code barre .Sur cette carte de prélèvement se trouve les empreintes digitales de la personne et son ADN.

Cependant les résultats d’analyse peuvent être disponible plus ou moins rapidement suivant le cas, en général cela requiert un mois sauf en cas d’urgence ou en huit heures cela est possible .Toutes analyses est ainsi enregistrées dans le fichier national des empreintes génétiques (FNAEG) .

 

3) Observations :

Avant tout charlotte, gants, et blouse sont trois choses indispensables afin de ne rien contaminer avec son propre ADN . Il faut en premier lieu déterminer la nature du scellé (sang ? salive ? sperme ?) qui sont analysés dans trois salles différentes.

L’analyse vérifie la nature de la trace à l’aide de réactifs (Le sperme prendra une couleur violette et les sécrétions vaginales la couleur rose).

Par ailleurs il faut vérifier qu’aucune personne n’a amené d’élément contaminant, c’est pour cela qu’avant de rendre le produit il est comparé à celui du personnel du laboratoire.

 

4) Extraction :

Le but de l’extraction va être d’isoler l’ADN des autres composés de la cellule (protéines et acides nucléiques autres que l’ADN tels que l’ARN etc...) pour cela il est nécessaire d’avoir des bains marie ( car il y a plusieurs paliers plus ou moins chaud ) et des centrifugeuses.( car elle permet par la force centrifuge de séparer les différent constituants )

La matière extraite est ensuite placée dans des tubes, un de ceux-ci va servir de témoin négatif car il faut être sur que le profil génétique ne vient que du scellé et de rien d’autre. Ensuite un produit chimique est ajouté a la matière puis placé au bain-marie, le réactif va ainsi permettre d’éclater l’ADN.

L’incubation dur de une à quatre heures à une température de 56 degrés, ce qui permet de casser la membrane des cellules, le noyau pour mettre l’ADN à disposition. Des macro-billes sont alors visibles au fond du tube.

On le place ensuite dans une centrifugeuse. L’ADN extrait va se déposer sur les membranes, en revanche il ne se voit pas .

 

 

Extraction de l’ADN a la façon de la police scientifique

Extraction de l’ADN des cellules d’oignon ( TP fait pas les 3 membres du groupe)

 

 

I. Fragmentation des tissus

 

Les morceaux de tissus, prélevés directement sur les spécimens récoltés, doivent dans un premier temps être fragmentés, pour dissocier les tissus, les parois cellulaires, les membranes intracellulaires et les protéines qui entourent l’ADN . Une première étape mécanique peut-être nécessaire : Cela peut être réalisé à l’aide d’une machine : un mouvement latéral rapide et répété entraîne le déplacement d’une bille de métal placée dans le tube contenant le tissu, ce qui a pour effet de broyer les tissus

Etape 1 : Placer l’oignon éplucher et couper dans un mixeur

Etape 2 : Hacher l’oignon.

 

 

 

 

 

Dans une seconde étape, les tissus sont placés dans une solution tampon qui contient notamment un détergent, qui a pour effet de dissocier les membranes et une enzyme, la protéinase, activée à 56°C. Au cours de cette étape qui peut durer plusieurs heures, l’enzyme va « digérer » les protéines contenues dans la cellule, et notamment celles qui sont liées à l’ADN.

 

Etape 4 : Y ajouter deux pincées de sel de cuisine (NaCl).

 

 

Etape 5 : Verser l’eau tiède salée sur le hachis d’oignon, il doit être juste recouvert, mélanger à l’aide d’une cuillère.

Etape 6 : Ajouter 2 cuillères à café de liquide vaisselle et mélanger en tournant lentement. Le mélange devient visqueux. Attendre 5 minutes.

 

 

 

 

II. Séparation de l’ADN des autres constituants

 

L’ADN n’est donc plus maintenant associé aux autres constituants des cellules, mais reste mélangé avec ceux-ci dans le tampon d’extraction. Pour séparer l’ADN, plusieurs méthodes existent :

 

- différents agents chimiques peuvent permettre de séparer l’ADN des autres constituants, par exemple en obtenant 2 phases par ajout Chloroforme Iso-Amyle (CIA) et centrifugation, une qui contient l’ADN et l’autre les résidus que l’on veut éliminer. L’ADN est ensuite précipité, en ajoutant par exemple du NaCl (Chlorure de Sodium). C’est par ce procédé que l’ADN devient visible sous forme de « méduse ».

 

- la solution peut-être passée à travers une colonne chargée positivement qui agit comme un filtre en retenant l’ADN (chargée négativement) et en laissant passer les autres constituants.

Etape 7 : Verser le tout dans la passoire au dessus d’un becher, un liquide visqueux s’écoule. Presser pour obtenir le maximum de liquide.

 

 

Etape 8 : Quand le liquide a fini de s’écouler, verser un peu de ce liquide dans un tube à essais.

 

Etape 9 : Ajouter dans le tube une quantité égale d’alcool à brûler. Attention !

 


 

 

 

III. Encore une fois, selon la méthode employée à l’étape précédente, il existe plusieurs façons de récupérer l’ADN après nettoyage :

- après avoir ajouté les différents produits pour nettoyer l’ADN, le tube qui contient la solution et l’ADN est centrifugé. L’ADN se retrouve alors sous la forme d’un culot, c’est-à-dire un précipité solide collé au fond du tube qui contient le tampon. Il suffit ensuite d’évacuer le tampon sans faire tomber le culot, puis de laisser sécher l’ADN. L’ADN séché est ensuite élué dans un tampon adapté pour éviter sa dégradation

- l’ADN fixé à la colonne est ensuite « décroché » en ajoutant une solution qui inverse les relations d’affinité de la colonne pour l’ADN. Comme pour l’autre méthode, l’ADN est élué dans un tampon adapté

- dans le protocole proposé aux classes de seconde, la solution est simplement filtrée.

 

Etape 10 : Attendre 15 minutes, une substance se forme dans l’alcool au contact des 2 liquides, c’est l’ADN qui précipite on appelle sa la « méduse d’ADN »).

 

 

 

 

 

5) Amplification :

La technique d’amplification de l’ADN aussi appelé PCR (Polymerase Chain Reaction» ), consiste en un processus enzymatique permettant de multiplier les fragments non codants d’ADN soumis à l’analyse . Une PCR classique se déroule dans un  tube placé dans un appareil programmable appelé thermocycleur. Le thermocycleur place le tube aux températures voulues pendant les durées programmées et recommence en effectuant des cycles. Un cycle représente trois températures différentes pendant des durées différentes. 

Cette technique mise au point en 1985 par le scientifique américain Kary Banks Mulis permet d’obtenir l’empreinte génétique à partir d’une très faible quantité d’ADN ainsi que d’amplifier in vitro une région spécifique d’un acide nucléique afin d’obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.

 

     Avant la réaction, tous les « acteurs » de la PCR sont introduits dans le même tube. Il s'agit :

-         du fragment d'ADN à amplifier,

-         des amorces (ou oligonucléotides), dont la séquence est complémentaire à celle des extrémités du fragment d’ADN de manière à pouvoir s’hybrider avec elles.

-         de l'ADN polymérase (ici Taq polymérase)

-         du mélange des quatre nucléotides constitutifs de l'ADN.

Tous sont ajoutés en large excès par rapport à l'ADN. Le choix des amorces est très important car ce sont elles qui vont délimiter le début et la fin de la séquence à amplifier.

 

  • La dénaturation t =95°C : A cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d'ADN sont rompues pour donner deux simples brins d'ADN.

  • L’hybridation t =45-60°C : des amorces sur l'ADN repose sur le principe de l'assemblage des bases complémentaires.

Le choix de la température d'hybridation résulte d'un compromis entre plusieurs paramètres. Elle est calculée en fonction de la longueur et de la séquence des amorces.

 

  • Elongation (extension des amorces) t =72°C : Les amorces hybridées à l'ADN servent de point de départ à la polymérisation du brin d'ADN complémentaire de l'ADN matrice. La polymérisation se fait par ajout successif des désoxyribonucléotides (présents dans le mélange en large excès). Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice.

Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l'ADN de l’amorce jusqu’à la fin de la séquence d'ADN à amplifier. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées. Ces polymérases ne sont donc pas dénaturées par la chaleur. La plus connue est la Taq polymérase.

La polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée car la Taq polymérase poursuit la synthèse au-delà de la longueur souhaitée. La copie de l'ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaitées.

 

 

Ce cycle va se répéter de multiples fois, doublant à chaque cycle le nombre de doubles hélices d’ADN, afin de pouvoir en prélever un maximum pour les étapes suivantes

 

 

 

 

 

 

 

 

6) Traitement enzymatique :

 

Le traitement enzymatique consiste a prendre la région 5’ et la région 3’, situés aux deux extrémités du gène , qui sont des régions non codantes ( non traduites). L’ADN non transcrit est appelée ADN intergenique ou extragénique , certaines séquences d’ADN intergeniques situées à proximités des gènes exprimés sont indispensables au contrôle de l’expression des gènes . Dans l’ADN intergenique sont situées des séquences répétées , dispersées au sein du génome , en une ou plusieurs copies .

Le traitement enzymatique consiste a prendre une zone précise de l’ADN grâce « l’ADN intergenique «  grâce a des enzymes de restrictions , on dit que l’ADN intergenique est hypervariable car d’une personne a l’autre celui-ci est trés varié .

 

 

 

 

 

7) Electrophorèse

 

le TP avec l'électrophorèse a été fait par les 3 membres du groupe

 

 

 

                                       Gel d’Agarose

 

  • Préalablement le matériel avait été stérilisé ainsi que la préparation du gel d’Agarose.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • Il nous été fourni :

    1*20microlitre d’ADN du suspect A

    1*20microlitre d’ADN du suspect B

     1*20microlitre d’ADN du suspect C

     1*20microlitre d’ADN lieu du crime

     1*5 microlitre de marqueur de taille

     

  • On prélève 20 microlitre de chaque ADN

(et seulement 5 microlitre de marqueur de taille suffisent)

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • On dépose directement les 20microlitres de chaque ADN dans les puits de gel d’agarose.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

On remplit la cuve a l’aide de tampon TBE qui recouvre légèrement le gel





















 

 

 

 

 

 

 

 

 




  • On branche la cuve a la prise de courant (100 volt pendant 30 minutes)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • On retire le gel de la cuve et on le place dans un récipient , puis on le rince a l’eau distillé puis de gel de solution A et on le laisse 5 minutes puis on le rince dans un bain d’eau.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  • Apres quelque minutes de repos on peut constater l’avancement des bandes ( notre résultat correspond bien avec l’ADN lieu du crime) 

 

 

 

 

 

 

 

L’électrophorèse d’ADN est une technique permettant de séparer des fragments d’ADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un gel d’Agarose ( polymère à base d’agar purifié plus précisément d’un tampon TBE et d’Agarose a 0.8%) en les soumettant a un courant électrique . Cette

séparation s’effectue à travers la matière du gel d’Agarose, les molécules les plus de petites tailles migrent plus loin que celles de tailles supérieurs.

L’électrophorèse est constituée de 5 étapes essentielles :

  • La préparation des gels d’Agarose :

Dont la réussite dépend en grande partie de la qualité du gel qui va assurer la bonne migration des fragments ADN.

Il faut porter à ébullition la solution (5g d’Agarose pour 100mL de tampon TBE)et le transvaser dans le moule contenu dans la cuve du tampon TBE et le laisser refroidir jusqu’à solidification .

 

  • Dépôt de l’ADN dans les puits :

Il faut remplir la cuve du tampon TBE jusqu’à recouvrir légèrement le gel. Les fragments d’ADN sont mélangés avec un bleu de dépôt qui permet d’alourdir l’ADN pour qu’il tombe au fond des puits lors des dépôts et de suivre l’avancée de la migration car le bleu de bromophénol marque le front de migration des plus petits morceaux d’ADN. Puis déposé 20 microlitre d’ADN au fond de chaque puits.

 

  • Migration :

Il faut pour cela brancher la cuve a la prise de courant et régler la tension a 70V (plus la tension est élevé , plus la migration est rapide mais moins précise ) . Ensuite il faut arrêter la migration quand le bleu de bromophénol( bleu foncé) arrive a 1cm de l’extrémité du gel

 

  • Coloration :

Retirer le gel de la cuve et le placer dans un récipient, puis le rincé a l’eau distillé, le recouvrir de gel de solution d’azur A et le laisser 5 min, vider le colorant et laisser reposer le gel quelques minutes. Rincer le gel dans un bain d’eau. Les bandes s’observent au bout de quelques heures passé a 4°C .

 

  • Observation :

Le gel se conserve pendant 2 mois a 4°C

 

8) Résultats :

Le profil génétique se dessine .Une machine permet de réaliser une électrophorèse capillaire afin d’identifier l’ ADN .On obtient ensuite un electrophoregramme (une succession de pics sur une feuille) qui correspond a u profil génétique de l’individu.

Faut –il encore que les résultats soit exploitables. L’electrophoregramme est donnés aux experts.

 

9) Rapport

L’expert effectue donc son rapport qui reprend tout le cheminement analytique.

Si le profil de l’individu n’est pas enregistré dans le fichier national des empreintes génétique (FNAEG) , on ne peut donc pas savoir à qui il appartient.

En revanche si il est fiché on en déduit que le suspect était sur le lieu du crime mais cela ne justifie pas sa culpabilité, cette expérience nous démontre uniquement sa présence.

L’expert va donc ensuite défendre son rapport devant les assises au moment du procès et expliquera s’il a observé des concordances grâce a l’analyse.

 

 

10) Recherche d’éventuelles traces de sang au moyen du luminol qui rendra visible du sang qui a été nettoyé.

Une simple exposition à une lampe à ultraviolet aide à repérer les traces. Mais elle ne suffit pas si l’endroit a été nettoyé. Plusieurs révélateurs peuvent alors être employés. C’est en fait le fer contenu dans l’hémoglobine des hématies qui sert « d’indic » aux deux principales substances utilisées : la fluorescéine et le luminol. La première brille quand elle est soumise à des ultraviolets. La seconde le Blue Star. Son point fort étant qu’il ne détruit pas l’ADN

 

Dans une pièce plongée dans l’obscurité, le Blue Star est pulvérisé à environ un mètre de distance sur les surfaces suspectées . Une lumière bleue fluorescente révèle les traces de sang jusqu’à une dilution de 1/10 000. Autre mesure : avec un litre de sang versé, il faudrait 200 litres d’eau pour faire disparaître les traces. Le Blue Star peut certes produire des « faux positifs » en réagissant à certains produits d’entretien comme la javel qui contient du sodium et sert « souvent » au nettoyage des scènes de crime. Mais la fluorescence est alors plus rapide et plus brève, minimisant ainsi les risques de confusion.

 

  • Mais comment se fait-il que le sang devienne fluorescent au contact du luminol ?

Le Luminol est un composé organique qui devient luminescent dans certains milieux oxydants

(milieux qui acceptent des électrons).

 

 

 

                       Forme cyclique du la molécule de luminol (elle se referme sur elle-même)


Le Luminol est une molécule qui réagit directement avec l’eau oxygénée. Cette eau oxygénée va oxyder le luminol qui va ensuite dégager son trop d’énergie sous forme de photons

 

 

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